نئوستیگمین از هیدرولیز استیل کولین به وسیله استیل کولین استراز جلوگیری می‌کند و در نتیجه انتقال تکان‌های عصبی از محل اتصال عصب – عضله را تسهیل می‌نماید. نئوستیگمین می‌تواند بر سلول‌هاو نرون‌های گانگلیون اتونوم در CNS نیز اثر نماید. این دارو همچنین با افزایش تحریک و تنوس عضلات معده، کاهش انقباض معده بعد از عمل جراحی را بر طرف می‌کند. دارو با طولانی کردن اثر استیل کولین در صفحه انتهایی باعث افزایش قدرت عضلانی بیماران میاستنی گراو می‌شود، در حالیکه این اثر نزد سایر بیماران مشاهده نمی‌شود.