متوترکسات آنالوگ آنتی نئوپلاستیک فولیک اسید است که با اتصال به آنزیم دی هیدروفولات ردوکتاز(DHFR) از تبدیل دی هیدروفولات (FH۲) به تتراهیدروفولات(FH۴) جلوگیری می‌کند. فولات برای ساخت طبیعی پورین‌ها و پیریمیدین‌ها و در نتیجه ساخت DNA و RNA ضروری است. فولات برای ایفاء نقش خود به عنوان کوفاکتور باید به وسیله آنزیم DHFR به FH۴ تبدیل شود. متوترکسات به آنزیم DHFR اتصال یافته و از تبدیل FH۲ به FH۴جلوگیری می‌کند، در نتیجه، از ساخت پورین و پیریمیدین جلوگیری می‌شود. آنتی متابولیت‌ها در فاز S یا ساخت چرخه سلولی دخالت می‌کنند.