کلوتریمازول با ممانعت از تقسیم و رشد قارچ عمل می‌کند. کلوتریمازول یک داروی متوقف کننده رشد قارچ است ولی بسته به مقدار مصرف می‌تواند کشنده قارچ نیز باشد. این دارو بیوسنتز ارگوسترول یا سایر استرولها را مهار نموده و با آسیب رساندن به غشا سلولی قارچ و تغییر در نفوذپذیری آن، موجب خروج عناصر ضروری داخل سلولی و مرگ آن می‌شود. این دارو همچنین بیوسنتز تری گلیسیریدها و فسفولیپیدها توسط قارچ را مهار می‌کند. علاوه بر این، این دارو با مهار فعالیت اکسیداتیو و پراکسیداتیو آنزیم‌ها، سبب ساخت غلظتهای سمی هیدروژن پراکساید در داخل سلول شده که ممکن است منجر به از بین رفتن اندامکهای داخل سلول و نکروز سلولی گردد. در کاندیدا آلبیکانس، این دارو از تبدیل بلاستورسپورها به شکل میسلی فعال قارچ جلوگیری می‌کند.